AKUAKULTUR: Pewarnaan Gram

LAPORAN TETAP

PRAKTIKUM DASAR-DASAR MIKROBIOLOGI AKUATIK

PEWARNAAN GRAM

Anggi Meisardi

05051181419041

PROGRAM STUDI AKUAKULTUR

DAN TEKNOLOGI HASIL PERIKANAN

FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS SRIWIJAYA

2015
BAB 1

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Pada praktikum proses pewarnaan gram olesan bakteri yang terfiksasi dikenai larutan-larutan berikut dalam urutannya yaitu ungu kristal, larutan yodium, alkohol (bahan pengecat), dan safranin atau beberapa pewarna tandingan lain yang sesuai. Bakteri yang diwarnai dengan metode gram ini dibagi menjadi dua kelompok. Salah satu di antaranya, bakteri gram positif, mempertahankan zat pewarna ungu kristal. Di gunakan untuk pengecatan differensial, menggunakan beberapa jenis zat, di gunakan untuk mengelompokkan bakteri, seperti pengecatan gram atau pengecatan acid-fast, bakteri gram negatif, kehilangan ungu kristal ketika dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi pewarna tandingan dengan warna merah safranin, tampak berwarna merah(Pelczar dan Chan, 1986).

Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Olek karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi(Pelczar dan Chan, 1986).

Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa(Dwidjoseputro, D. 2002).

Teknik Pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan kecermatan bekerja serta mengikuti aturan dasar yang berlaku. Oleh karena itu yang melatar belakangi praktek ini yaitu untuk mengetahui teknik pewarnaan mikroorganisme sehingga mempermudah dalam melihat bagian-bagian bakteri. Diharapkan dengan percobaan ini, mahasiswa mampu melakukan berbagai pewarnaan bakteri sesuai dengan peruntukannya(Dwidjoseputro, D. 2002).

1.2. Tujuan

1. Mempermudah melihat bentuk jasad renik

2. Memperjelas ukuran dan bentuk jasad renik

3. Melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri yang diamati

BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Pewarnaan Gram

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka(Fitria. 2009).

a. Bakteri Gram Negatif

Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negative tidak(Fitria. 2009).

b. Bakteri Gram Positif

Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri (Fitria. 2009).

Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru (Fitria, 2009).

Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek (Fitria, 2009).

2.2. Macam-macam Pewarnaan

Pewarnaan pada bakteri dibagi menjadi tiga, yaitu :

2.2.1. Pewarnaan sederhana

Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dengan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah metilen biru, kristal violet, dan karbol fuehsin yang mana pewarnaan sederhana ini dibagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan(Hadioetomo, 1993).

a. pewarnaan asam

Merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel. Adapun zat warna yang dipakai dalam pewarnaan positif adalah metilen biru dan air furksin.

b. Pewarnaan Basa

Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina.

2.2.2. Pewarnaan Diferensial

2.2.2.1. Pewarnaan Gram

a. Bakteri Gram Negatif

b. Bakteri Gram Positif

Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek (Fitria, 2009).

2.2.2.2. Pewarnaan tahan asam

Pewarnaan tahan asam yang umum digunakan adalah pewarnaan Zieh – Neelson dengan pewarna utama karbol fuksin dengan pemanasan dan pewarna tandingan metilen blue Loeffler. Perlakuan panas tersebut diganti dengan penggunaan pembasah yaitu suatu deterjen untuk mengurangi tegangan permukaan lemak, untuk menjamin penetrasi. Pewarna yang mengandung pembasah ini disebut pewarna Kinyoun (Hadioetomo, 1993).

Sekali sitoplasma terwarnai, maka sel-sel organisme seperti mikobakteri menahan zat warna tersebut dengan erat, artinya tidak terpucatkan sekalipun oleh zat yang bersifat keras seperti asam alkohol (yaitu 3% HCL dalam etanol 95%). Alkohol asam ini merupakan pemucat yang sangat intensif dan jangan dikelirukan dengan alkohol-aseton yang banyak digunakan dalam prosedur pewarnaan Gram. Kondisi pewarnaan ini, organisme yang dapat menahan zat warna itu dikatakan tahan asam dan tampak merah. Bakteri biasa yang dindingnya tidak bersifat terlampau lipoidal, pewarna karbol fuksin yang mewarnai sel dapat dengan mudah dipucatkan oleh alkohol-asam dan karenanya dikatakan tak tahan asam. Tercucinya karbol fuksin dapat diperagakan oleh terserapnya pewarna tandingan biru metilen oleh sel, sehingga bakteri tersebut tampak biru (Hadioetomo, 1993).

Pewarnaan Ziehl Neelsen. Larutan carbol fuchsin 0,3% dituang pada seluruh permukaan sediaan, kemudian dipanaskan diatas nyala api sampai keluar asap tetapi tidak sampai mendidih atau kering selama 5 menit. Sediaan kemudian dibiarkan dingin selama 5-7 menit lalu kelebihan zat warna dibuang dan dicuci dengan air yang mengalir perlahan. Setelah itu larutan asam alkohol 3% (hydrochloric acid-ethanol) dituang pada sediaan dan dibiarkan 2-4 menit kemudian dicuci dengan air mengalir selama 1-3 menit, kelebihan larutan dibuang. Larutan methylene blue 0,1% dituang sampai menutup seluruh permukaan, dibiarkan 1 menit lalu larutan dibuang dan dicuci dengan air mengalir (Karuniawati, 2005).

2.2.3. Pewarnaan Khusus

Pewarnaan khusus merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai struktur khusus atau tertentu dari bakteri seperti bagian spora, kapsul, flagel dsb. Contoh pewarnaan khusus :Pewarnaan Endospora Anggota dari genus Clostridium, Desulfomaculatum, dan Bacillus adalah bakteri yang memproduksi endospora dalam siklus hidupnya. Endospora merupakan bentuk dorman dari sel vegetatif, sehingga metabolismenya bersifat inaktif dan mampu bertahan dalam tekanan fisik dan kimia seperti panas, kering, dingin, radiasi, dan bahan kimia. Tujuan dilakukannya pewarnaan endospora adalah membedakan endospora dengan sel vegetatif, sehingga pembedaannya tampak jelas. Endospora tetap dapat dilihat di bawah mikroskop meskipun tanpa pewarnaan dan tampak sebagai bulatan transparan dan sangat refraktil. Namun jika dengan pewarnaan sederhana, endospora sulit dibedakan dengan badan inklusi (Suriawiria, 2005).

a. Pewarnaan kapsul

Pewarnaan ini menggunakan larutan kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat sebagai pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika pembilasan dengan air dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi warna pada latar belakang yang berwana biru gelap.

b. Pewarnaan spora

Dinding spora relatif tidak permeable, namun zat warna bias menembusnya dengan cara memanaskan preparat.

c. Pewarnaan flagel

Pewarnaan flagel dengan memberi suspensi koloid garam asam tanat yang tidak stabil, sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel.

d. Pewarnaan nucleoid

Pewarnaan nucleoid menggunakan pewarna fuelgen yang khusus untuk DNA (Suriawiria. 2005).

2.3. Perbedaan Gram Positif dan Negatif

Bakteri adalah sel prokariot yang khas, uniseluler dan tidak mengandung struktur yang terbatasi membran di dalam sitoplasmanya. Bakteri dapat diklasifikasikan berdasarkan metoda pewarnaan gram menjadi dua kelompok besar, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Pewarnaan ini membedakan bakteri berdasarkan karakteristik fisik dan kimia dinding selnya(Manurung, 2010).

Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna kristal violet sewaktu proses pewarnaan Gram sehingga akan berwarna merah bila diamati dengan mikroskop. Sedangkan gram positif akan akan berwarna ungu. Bakteri gram positif seperti Staphylococcus aureus hanya mempunyai membran plasma tunggal yang dikelilingi dinding sel tebal berupa peptidoglikan. Sekitar 90 % dari dinding sel tersebut tersusun atas peptidoglikan sedangkan sisanya berupa molekul lain bernama asam teikhoat. Di sisi lain, bakteri gram negatif memiliki sistem membran ganda dimana membran plasmanya diselimuti oleh membran luar permeabel. Bakteri ini mempunyai dinding sel tebal berupa peptidoglikan, yang terletak di antara membran dalam dan membran luar(Manurung, 2010).

Perbedaan relatif sifat bakteri gram positif dan gram negatif.

Sifat	Bakteri garam (+)	Bakteri gram negatif(-)
Komposisi dinding sel	Kandungan lipid rendah (1-4%)	Kandungan lipid tinggi
Ketahanan terhadap penisilin	Lebih sensitif	Lebih tahan
Penghambatan oleh pewarna basa (VK)	Lebih dihambat	Kurang dihambat
Kebutuhan nutrisi	Kebanyakan spesies relatif kompleks	Relatif sederhana
Ketahanaa terhadap perlakuan fisik	Lebih tahan	Kurang tahan

BAB 3

PELAKSANAAN PRAKTIKUM

3.1. Waktu dan Tempat

Praktikum Dasar-dasar Mikrobiologi Akuatik ini dilaksanakan di Laboratorium Bersama Budidaya Perairan dan Teknologi Hasil Perikanan, Fakultas Pertanian, Universitas Sriwijaya pada pukul 14.30 WIB sampai dengan selesai.

3.2. Alat, Bahan dan Metoda

Alat, bahan dan metoda yang akan digunakan dalam praktikum ini adalah sebagai berikut :

3.2.1. Alat

Alat yang akan digunakan pada praktikum pewarnaan gram ini disajikan pada Tabel 3.1. sebagai berikut:

Tabel 3.1. Alat yang digunakan pada praktikum

No	Nama Alat	Jumlah	Fungsi
1	Bunsen	1 buah	Sterilisasi
2	Kaca Preparat	8 buah	Tempat bakteri
3	Korek api	1 buah	Menyalakan bunsen
4 5	Pipet Tetes Mikroskop	1 buah 1 buah	Untuk meneteskan indikator Untuk meihat bakteri

3.2.2. Bahan

Bahan yang akan digunakan pada praktikum pewarnaan gram ini disajikan pada Tabel 3.2., sebagai berikut.

Tabel 3.2. Bahan yang digunakan pada praktikum

No	Nama Bahan	Jumlah	Fungsi
1	Air	Secukupnya	Untuk membilas
2	Kristal violet	Secukupnya	Sebagai zat pewarna
3	Lugol iodin	Secukupnya	Sebagai pelekat
4	Alkohol	Secukupnya	Sebagai pelarut
5	Safranin	Secukupnya	Sebagai zat pewarna

3.2.3. Metoda

Metoda yang digunakan pada praktikum ini adalah sebagai berikut :

1. Ambil bakteri kemudian letakkan di atas kaca preparat,lalu difiksasi.

2. Teteskan kristal violet (2-3 tetes), tunggu sampai kering.

3. Bilas dengan aquades.

4. Teteskan lugol iodin (2-3 tetes), tunggu sampai kering.

5. Bilas dengan aquades.

6. Teteskan alkohol (2-3 tetes), keringkan.

7. Teteskan safranin (2-3 tetes), keringkan.

8. Bilas dengan aquades.

9. Amati dengan mikroskop.

BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil

Hasil dari praktikum pembuatan media agar ini adalah sebagai berikut:

Bakteri Streptococcus

Bakteri Aeromonas

4.2. Pembahasan

Pewarnaan gram menggunakan bakteri Streptococcus dan Aeromonas. Pengecatan gram ini terdiri dari beberapa tahapan dimana violet kristal berfungsi sebagai cat utama, larutan lugol iodin berfungsi untuk melekatkan bakteri ke kaca preparat, larutan alkohol 70% digunakan sebagai peluntur dan safranin berfungsi sebagai cat penutup. Pada tahap pengecatan gram dilakukan proses fiksasi yang bertujuan untuk melekatkan sel bakteri pada kaca objek, untuk membunuh sel bakteri tanpa merusak struktur bakteri dan untuk mencegah autolisis sel (Soetarto, 1995).

Hasil pengecatan tersebut dapat dibedakan yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Pada prosedur pewarnaan gram mewarnai pada bakteri Streptococcus menjadi ungu dan pada bakteri Aeromonas menjadi merah karena hal ini tampaknya disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi permukaannya (Dwidjoseputro, 2002).

Bakteri gram positif berwarna ungu adalah bakteri yang mampu mengikat kuat cat utama violet kristal dan tidak terlunturkan oleh aseton alkohol. Sehingga tidak terpengaruh cat penutup safranin. Bakteri gram negatif berwarna merah adalah bakteri yang dinding selnya tidak mampu menyerap kuat cat utama violet kristal sehingga mudah terlunturkan oleh alkohol dan akhirnya selnya tertutup cat penutup safranin (Soetrarto, 1995).

Pewarnaan gram masih merupakan salah satu prosedur yang paling banyak digunakan untuk mencirikan banyak bakteri. Terutama amat berarti di laboratorium diagnostik rumah sakit karena informasi yang diperoleh dari pengamatan spesimen yang diwarnai dengan pewarnaan gram dengan cepat dapat memberi petunjuk akan organisme penyebab suatu infeksi (Pelczar, 1986).

Bakteri gram negatif berbeda dari bakteri gram positif yaitu bakteri gram negatif lebih rentan terhadap asam antibiotik seperti streptomisin. Bakteri gram positif pada umumnya lebih rentan terhadap antibiotik penisilin dan kurang rentan terhadap disintegrasi oleh perlakuan mekanis atau bila diberi enzim-enzim tertentu(Soetarto, 1995).

Faktor-faktor yang mempengaruhi dalam pewarnaan mikrobia antara lain adalah fiksasi, peluntur warna, subtrat, intensifikasi pewarna untuk mempercepat pewarnaan mikrobia sehingga zat akan terikat lebih mudah di dalam jaringan. Zat warna penutup untuk memberikan warna kontras pada sel mikrobia, yang diwarnai yang tidak menyerap warna pula (Soetrarto, 1995).

BAB 5

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1. Kesimpulan

Kesimpulan yang didapat pada praktikum pewarnaan gram ini adalah sebagai berikut:

1. Pewarnaan bertujuan agar bakteri dapat terlihat oleh mikroskop, karena pada dasrnya bakteri tidak memiliki zat warna.

2. Perbedaan pada garam negatif dan gram positif terletak pada warnanya pada gram positif berwarna ungu kareana dapat mempertahankan zat pewarna kristal violet serta perbadaan terjadi pada dinding selnya.

3. Pewarnaan bakteri dipengaruhi faktor-faktor antara lain fiksasi, pelunturan warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup.

4. Sifat pewarnaan pada bakteri disebabkan oleh perbedaan susunan dari dinding sel bakteri gram positif dan negative.

5. Bakteri gram negatif bewarna merah karena pewarna utama larut oleh alkohol sehingga ia tertutupi oleh safrani.

5.2. Saran

Sebaiknya saat praktikum alatnya di perbanyak sehingga semua praktikan mencoba sendiri-sendiri. Karena jika praktikan bisa mencoba sendiri-sendiri itu lebih mudah untuk dipahami.

DAFTAR PUSTAKA